3. PRODUCCIÓN DE PHA EN BACTERIAS
Habitualmente suele asociarse a las bacterias con el concepto de enfermedad. Pero esto no siempre es así. Si bien algunos microorganismos pueden provocar infecciones, la gran mayoría de ellos cumple alguna función necesaria para mantener el equilibrio de la naturaleza.
Además, el ingenio del hombre ha permitido utilizar algunos microbios para su provecho, por ejemplo, en la producción de alimentos y medicamentos.
En los últimos años, los científicos han puesto a trabajar a las bacterias con una nueva finalidad: la producción de plásticos.
En la siguiente tabla se muestran algunas de las bacterias productoras de PHAs más importantes
3.1 Primeros intentos de producción. Breve historia del comienzo de los PHA
3.2 Ejemplo de producción de PHA en Escherichia coli
3.3 Papel fundamental de los pha en la supervivencia bacteriana
3.4 Mecanismo de resistencia al estrés
3.5 Estudio de la relación: degradación de PHA y respuesta antiestrés
3.1 Primeros intentos de producción. Breve historia del comienzo de los PHA
En los años 70 hubo una crisis mundial de petróleo, en la que el precio del combustible fósil creció mucho. En ese contexto, las investigaciones alrededor de los PHA florecieron, y la empresa ICI desarrolló un proceso para producir a escala industrial un bioplástico que se comercializó bajo el nombre de “Biopol”. Este polihidroxialcanoato es un copolímero de monómeros de cuatro y cinco carbonos, denominados hidroxibutirato e hidroxivalerato, respectivamente.
El “Biopol” se producía utilizando la bacteria Ralstonia eutropha cultivada en un medio con glucosa y propionato como fuentes de carbono. A pesar de su costo relativamente elevado, el “Biopol” fue utilizado en varias aplicaciones en algunos países como Alemania.
A finales del siglo XX el precio del petróleo disminuyó, y de la misma manera decayó el interés por los PHA.
En los últimos años esta tendencia se ha invertido: además de producirse un aumento en el precio del petróleo, se ha tomado mayor conciencia de que las reservas se están agotando de manera alarmante. Las estimaciones varían mucho, ya que la información que suministran los países que tienen reservas de petróleo no siempre es fiable, pero lo más probable es que comiencen a agotarse en las próximas décadas. Ante esta perspectiva, las investigaciones que involucran a los plásticos obtenidos a partir de otras fuentes han tomado un nuevo impulso, y los polihidroxialcanoatos aparecen como una alternativa altamente prometedora.
En los comienzos de la historia de los polímeros biodegradables debemos citar a la empresa agrícola Cargill y la química Dow Chemical, ambas estadounidenses. Descubrieron que ciertas bacterias transforman, por fermentación, el azúcar del maíz en ácido láctico. Por medio de otro proceso químico, las moléculas de ácido láctico se reúnen en cadenas para formar un biopolímero (ácido poliláctico, o PLA, por sus siglas en inglés) de propiedades semejantes a las del plástico que se usa para hacer botellas de refresco y fibras textiles, pero además biodegradable.
Éste es otro tipo de biopolímero distinto al que voy a intentar desarrollar en este trabajo: el PHA. Bacterias como la Ralstonia eutropha, convierten directamente azúcares en PHA, éste se acumula en la bacteria y llega a constituir hasta el 90% del peso de la misma. Algunas empresas, entre ellas la Imperial Chemical Industries, han usado la bacteria Ralstonia eutropha para obtener PHA. Una vez que la bacteria se llena de gránulos de plástico, éstos se extraen para obtener el material.
La principal ventaja de estos biopolímeros es que se biodegradan muy rápido, ¡hasta un 80% en sólo siete semanas! La desventaja es que el proceso de elaboración es muy costoso: se calcula que producir por fermentación bacteriana un kilogramo de PHA cuesta 15 dólares, mientras que hacer un kilogramo de plástico convencional cuesta sólo un dólar. Uno de los principales motivos de esta diferencia es que las bacterias requieren fuentes externas de alimento, como la celulosa.
3.2 Ejemplo de producción de PHA en Escherichia coli
Los productores naturales de PHA, como Azotobacter, se han adaptado a la acumulación de estos polímeros durante la evolución, pero normalmente tienen un tiempo de generación largo y temperaturas de crecimiento relativamente bajas. Además, son difíciles de lisar y poseen enzimas que degradan el polímero acumulado. Estas características dificultan su uso en la producción industrial de los biopolímeros.
Por ello se empleará la bacteria Escherichia coli para producir indirectamente PHA debido a sus buenas propiedades biotecnológicas
Entre las cepas bacterianas comúnmente utilizadas en procesos biotecnológicos, E. coli es el microorganismo mejor conocido, ya que su metabolismo ha sido extensivamente estudiado y caracterizado. Debido a esto, es un microorganismo ideal para su uso en fermentaciones. Además, debido al gran número de herramientas disponibles para realizar manipulaciones genéticas, es el organismo adecuado para realizar ensayos previos al traspaso de los genes a plantas.
E. coli no posee la capacidad de sintetizar o degradar PHA pero crece rápido y es fácil de lisar. Se empleará esta bacteria para producir indirectamente PHA debido a sus buenas propiedades biotecnológicas. Se han expresado los genes pha de varias especies bacterianas en E.coli, obteniéndose buenos rendimientos del polímero. Asimismo, al no poseer enzimas que degraden a los PHA, permite la acumulación de polímero con un elevado peso molecular.
Los genes necesarios para la síntesis de PHB de Azotobacter (phaB, phaA y phaC) han sido clonados y caracterizados en el laboratorio y transferidos a una cepa de E. coli adecuada para la producción del polímero.
Más adelante, en la parte dedicada a la síntesis de PHB, se describe con detalle el proceso
3.3 Papel fundamental de los PHA en la supervivencia bacteriana
La gran mayoría de los seres vivos acumulan diferentes sustancias de reserva cuando existe un exceso de recursos en su entorno. Cuando los nutrientes se vuelven escasos, son utilizadas para poder sobrevivir.
Entre las sustancias de reserva acumuladas por los organismos procariotas se encuentran los polihidroxialcanoatos (PHA). Estos polímeros son acumulados en gránulos intracelulares por numerosas especies de bacterias, en condiciones limitantes de nutrientes esenciales para el crecimiento (tales como nitrógeno combinado, azufre o fosfatos) y exceso en la fuente de carbono. Cuando la fuente de carbono externa se agota, o si el nutriente limitante es suministrado nuevamente, el PHA es depolimerizado y posteriormente metabolizado como fuente de carbono y energía.
La utilización de dicho polímero es considerada una estrategia desarrollada por las bacterias para incrementar su supervivencia en ambientes cambiantes. Los PHA son utilizados como fuente de carbono y energía en condiciones de escasez de nutrientes, como fuente de carbono y energía para el enquistamiento y la esporulación, para la degradación de compuestos tóxicos, y como fuente de poder reductor.
Determinar las diferentes condiciones en las que una bacteria sintetiza PHA, no sólo permite comprender los mecanismos moleculares que sustentan esta estrategia desarrollada por los microorganismos para sobrevivir en ambientes cambiantes, también brinda el conocimiento necesario para optimizar los métodos de producción de PHA.
3.4 Mecanismo de resistencia al estrés
Los primeros trabajos realizados por los investigadores para averiguar el rol de los PHA en la célula bacteriana demostraron que las cepas capaces de sintetizar el polímero de reserva tenían mayor supervivencia, y más capacidad de competir con otras bacterias autóctonas en ambientes naturales.
Para probarlo, hicieron crecer diferentes especies de microorganismos en agua de río y en microcosmos de suelo. Colocando en esos medios cepas que podían producir PHA y otras incapaces de sintetizarlos, comprobaron que las primeras tenían una mayor sobrevida.
Los resultados de estos experimentos hicieron pensar a los investigadores si era la sola presencia de PHA en la bacteria la clave para la supervivencia, o si era alguna forma de utilización de ese polímero lo que producía la ventaja adaptativa.
Para esclarecerlo, trabajaron con una cepa mutante de Pseudomona putida, que carece de la enzima responsable de degradar PHA, y compararon su sobrevida en agua de río con la de una cepa salvaje (que sí tiene la enzima) de la misma especie. El resultado de la prueba demostró que la incapacidad de degradación de PHA era una desventaja para la supervivencia.
El mismo ensayo, pero esta vez realizado en agua de río estéril, produjo los mismos efectos, con lo cual los investigadores pudieron descartar que la comunidad bacteriana natural pudiera tener alguna influencia en esos resultados.
El modelo de Pseudomona putida resultó útil para diseñar otros experimentos similares en los que se comparó la capacidad de ambas cepas para sobrevivir ante diferentes factores de estrés. Así, también se pudo comprobar que la exposición al etanol, o al estrés térmico, era resistida mejor por los microorganismos que tenían la capacidad de degradar PHA que por aquellos que, aunque disponían del polímero, eran incapaces de utilizarlo.
Pero ahora surgía una nueva pregunta: ¿de qué manera la utilización de los PHA favorece la supervivencia bacteriana en situaciones ambientales desfavorables? Lo veremos en el siguiente apartado
3.5 Estudio de la relación: degradación de PHA y respuesta antiestrés
Los resultados descritos anteriormente demuestran que los PHA juegan un papel importante en la supervivencia bacteriana ante condiciones de estrés. Sin embargo, poco se conoce acerca de los mecanismos mediante los cuales la utilización de PHA favorece la supervivencia bacteriana en condiciones desfavorables. En un trabajo realizado con R. eutropha en 1967, se sugirió que existía una asociación entre la utilización de los PHA y la fosforilación oxidativa.
Se sabe que, ante condiciones adversas, las bacterias son capaces de responder con diversos mecanismos de control activos que les permiten hacer frente a dichas condiciones. Uno de estos mecanismos es la respuesta general a estrés que se induce en bacterias Gram-negativas ante distintas condiciones de estrés ambiental, tales como escasez en nutrientes, estrés osmótico, estrés oxidativo y cambios bruscos de temperatura. Los genes involucrados en la resistencia al estrés se encuentran bajo el control de una subunidad sigma alternativa de la RNA polimerasa denominada sS, codificada por el gen rpoS, cuya función es controlar la expresión de los genes involucrados en la respuesta al estrés.
El otro mecanismo de protección bacteriana ante ambientes hostiles es el de respuesta estricta, que se caracteriza por reaccionar al estrés mediante un aumento en la concentración intracelular de tetrafosfato de guanosina (ppGpp), una molécula que regula la expresión de varios genes, entre ellos el rpoS, que es el que codifica la síntesis de sigma S.
Teniendo en cuenta que la degradación de PHA favorece la supervivencia y la resistencia a estrés de las bacterias en condiciones de escasez nutricional, en el laboratorio decidimos analizar si la degradación de PHA tenía algún efecto sobre los mecanismos de repuesta al estrés en las bacterias.
Para ello, recurrieron una vez más a las dos cepas de Pseudomona putida y las expusieron a un ayuno de carbono para que iniciaran la degradación del polímero. En esas condiciones, observaron que en la cepa que tenía la capacidad de despolimerizar PHA aumentaba la cantidad de ppGpp y de sigma S, en tanto que no ocurría lo mismo con la cepa mutante.
Para los investigadores, este resultado indica que existe una relación entre la degradación de los polihidroxialcanoatos y el mecanismo bacteriano de respuesta al estrés controlado por RpoS, que tal vez se encuentre mediado por ppGpp.
Se cree que todavía queda mucho por estudiar acerca de los PHA, pues el hecho de que sean un reservorio de carbono y energía los constituye en una molécula que debe cumplir funciones de gran importancia en el metabolismo central de la célula procariota, funciones que todavía están por desvelar.
Los resultados obtenidos en el laboratorio demuestran la influencia del PHA en los complejos mecanismos regulatorios involucrados en la respuesta al estrés, y abren el camino para investigar la conexión entre los factores que regulan la degradación de PHA y las redes globales de adaptabilidad bacteriana al ambiente.
Para poder desarrollar un proceso de producción de PHAs mediante fermentación utilizando microorganismos es necesario optimizar el rendimiento y la facilidad de purificación del polímero, y fundamentalmente abaratar el costo de los sustratos utilizados para su obtención.
Actualmente, existen varios procesos desarrollados para la producción de PHA por fermentación a partir de sustratos económicos: en Brasil se producen a partir de melaza de caña, y en Estados Unidos y Corea a partir de varios sustratos de origen vegetal.